很多時(shí)候，我們千辛萬(wàn)苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結(jié)果。這實(shí)在是一件憾事。其實(shí)，免疫組化結(jié)果分析的 protocol 教科書(shū)和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上面都有。今天主要談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧，并且有獨(dú)門(mén)絕招獻(xiàn)上，都是干貨喲。

對(duì)照染色 

和做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候必須設(shè)立對(duì)照組一樣，免疫組化也必須設(shè)立對(duì)照染色。沒(méi)有對(duì)照染色的免疫組化結(jié)果是不可信的。對(duì)照一般有陽(yáng)性組織對(duì)照，陰性組織對(duì)照，陰性試劑對(duì)照，自身對(duì)照。一般來(lái)說(shuō)，有一個(gè)陽(yáng)性組織對(duì)照和一個(gè)陰性組織對(duì)照就足夠了。 

定位 

抗原表達(dá)必須在特定部位。如 LCA 應(yīng)定位在細(xì)胞膜上；CK 應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi)；PCNA 及 p53 蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi)等等。不在抗原所在部位的陽(yáng)性著色，不能視為確切的陽(yáng)性結(jié)果。有可能是非特異性染色或者假陽(yáng)性。不能確定怎么辦？這就要用到上一段提到的對(duì)照染色了。

半定位 

現(xiàn)在一般用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。如果你的實(shí)驗(yàn)室不幸沒(méi)有那么高大上的話(huà)，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了。因?yàn)槿藶橹饔^性比較強(qiáng)，所以只能稱(chēng)作半定量。免疫組化的半定量一般就分為三級(jí)：弱（+），中（++），強(qiáng)（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強(qiáng)（+++）=3。至少隨機(jī)觀察 5-10 個(gè) HPF。然后根據(jù)（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 計(jì)算出數(shù)值；總數(shù)值 <1.0 者為（+），1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++)。

圖像分析儀 

如果要進(jìn)行精確定量的話(huà)，就要用到圖像分析儀。圖像分析儀類(lèi)型很多。這里就不一一介紹了。其實(shí)最想推薦的是一款圖像分析軟件：Image J。這是 NIH 開(kāi)發(fā)的免費(fèi)軟件。一般的免疫組化結(jié)果分析用它就綽綽有余了。網(wǎng)上可以免費(fèi)下載。其界面非常簡(jiǎn)潔。

現(xiàn)在，根據(jù)一個(gè)實(shí)例來(lái)看看如何用 Image J 來(lái)進(jìn)行圖像分析。如我們有一張細(xì)胞的免疫熒光染色的照片。那么，如何用 Image J 來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞的個(gè)數(shù)呢？

首先，要把彩色的圖像轉(zhuǎn)換成黑白圖像。步驟如下：Image→Type→16-bit。轉(zhuǎn)換成黑白圖像后，將要計(jì)數(shù)的部分用高亮標(biāo)示出來(lái)。步驟如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖動(dòng)鼠標(biāo)，直到所有的細(xì)胞被標(biāo)示出來(lái)。有時(shí)候 2 個(gè)細(xì)胞靠得比較緊密，會(huì)被計(jì)數(shù)為 1 個(gè)細(xì)胞。這個(gè)時(shí)候可以采用 Image J 的水洗功能。步驟如下：Image→Binary→Watershed。這些是本來(lái)計(jì)數(shù)成一個(gè)的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)水洗之后，更加精確地被計(jì)數(shù)成了 2 個(gè)細(xì)胞。

然后，就可以正式開(kāi)始分析了。步驟如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的結(jié)果之前，還有一些選項(xiàng)需要選擇。如果想要計(jì)數(shù)全部的細(xì)胞，那么 Size 項(xiàng)里面選擇“0-infinity"。 Circularity 的默認(rèn)值為“0.00-1.00"。一般就取默認(rèn)值。軟件自動(dòng)測(cè)量了每個(gè)細(xì)胞的大小。這里因?yàn)槭嵌S圖像，所以就是每個(gè)細(xì)胞的面積。

免疫組化是個(gè)苦活，時(shí)間長(zhǎng)，步驟多，還要經(jīng)常接觸有毒致癌物質(zhì)。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的結(jié)果。以上介紹了一些心得體會(huì)。希望廣大的同學(xué)們都能做出自己想要的結(jié)果，早點(diǎn)發(fā)文章。