部分分解多肽兩端有關(guān)的 PCR 法篩選 PK-120 基因?qū)嶒?/h1>

發(fā)布時間： 2022-03-24　　點擊次數(shù)： 911次

材料與儀器

PK-120
Sephadex-50 Gene Amp RNA PCR 試劑盒 合成寡聚核苷酸 抽提液 酵母 tRNA
PCR 擴增儀

步驟

實驗所需「試劑」具體見「其他」

1. 引物設(shè)計

PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中，最長序列 K-15，16 為引物設(shè)計的依據(jù)：

1.1 考慮全部編碼的組合，

1.2 考慮人編碼的使用頻率，設(shè)計 PCR 引物，正義鏈及反義鏈如用這些引物獲得的 PCR 產(chǎn)物當(dāng)中，50 bp 的產(chǎn)物為目的 cDNA。

2. PCR 擴增

從肝臟來源的 poly（A）+ RNA 中，用 Gene Amp RNA PCR 試劑盒如以下所述，合成 cDNA 0.1ug 的 poly（A）+ RNA 中，加入 5 mmol/L MgCl2：

1×PCR 緩沖液Ⅱ，

2 mmol/L dNTPs，

1u 的 RNase inhibitor，

2.5 umol/L random hexamers

2.5 u 反轉(zhuǎn)錄酶，

混勻，總體積為 20 ul。

在 PCR 擴增儀上反應(yīng)，PCR 參數(shù)為 ：

25℃ 10 min，

42℃ 30 min，

99℃ 5 min，

25℃ 5 min ，

第 1 循環(huán)反應(yīng)，合成 cDNA。

在反應(yīng)液中再分別加終濃度為 2 mol/L MgCl2，1×PCR 緩沖液Ⅱ，加 1nmol 3' 引物 5' 引物?；旌?，總體積為 100 ul。

94℃ 3 min 1 循環(huán)。

94℃ 1 min，

37℃～42℃，2 min，

72℃， 2 min，

40 循環(huán)。

72℃， 7 min，1 循環(huán)。

3. 凝膠電泳及提取 DNA

純化 PCR 產(chǎn)物后，在 0.25×TBE 溶液中，進(jìn)行 10％ 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分子量標(biāo)準(zhǔn)使用限制性酶 Msp1 消化的質(zhì)粒 pBR322。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)溴化乙錠染色，紫外照射，觀察到 50 bp 的 PCR 產(chǎn)物。將這 50 bp 的條帶切下，在抽提液中，室溫放置過夜之后 1200 r/min 4℃ 離心 10 min，回收上清。反復(fù)操作兩次，用乙醇沉淀 2 次，用 TE 液溶解，上樣 Sephadex-50 柱，再用乙醇沉淀洗脫組分，沉淀懸浮于 TE 溶液中。

4. 測定堿基序列

抽取提出的 PCR 產(chǎn)物用 PCRⅡ載體亞克隆，測定堿基序列。其結(jié)果以肝臟 poly mRNA 為模板，據(jù)引物 S15-i 和 A15-i 擴增的 50 bp 的 PCR 產(chǎn)物序列，和從氨基酸序列預(yù)測的堿基序列*一致。表明這是編碼母的部分分解多肽的 cDNA。

注意事項

常見問題

試劑：

Sephadex-50

Gene Amp RNA PCR 試劑盒

合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS，INC 公司產(chǎn)品合成寡聚核苷酸

抽提液

750 mmol/L 醋酸銨-10 mmol/L 醋酸鎂-0.1 mmol/L EDTA-0.1％SDS-1％TE 飽和酚

25ug/ml 酵母 tRNA

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物科技有限公司介紹：

安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。

下一篇：冰凍切片的原位雜交實驗

上一篇：標(biāo)簽酶消化釋放標(biāo)簽實驗