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    分離原代人角膜間質(zhì)細(xì)胞

    發(fā)布時(shí)間: 2022-12-09  點(diǎn)擊次數(shù): 742次

    原理


    材料與儀器

    完整的人角膜
    CMF-SaIineG 中性蛋白酶II L型膠原酶 1mg ml在DMEM F-12 GASP中 CMF-SaIineG配制的TrypLEExpress或0.25%膜蛋白酶 DMEM F-12 GASP DMEM F-12 2FB GASP:DMEM F-12 GASP含2%FBS CMF GASP
    3.5cm塑料組織培養(yǎng)皿或6孔板 手術(shù)刀或單刃的安全刀片 細(xì)胞濾網(wǎng) 70μm血液尼龍過(guò)濾網(wǎng) 塑料刮片 “CellLifter"或“CellScraper" 彎虹膜剪 11cm(4-3 8in.) Jeweler’s鑷 10cm(4in.) 角膜剪 19mm刀刃 尖頭 Colibri縫線鉗 0.1mm

    步驟



    (a)用CMF-SalineG清洗角膜3×5 min。


    (b)剪除殘留的鞏膜,結(jié)膜和虹膜。


    (c)加人2ml 1.2U中性蛋白酶II,4℃搖床搖動(dòng)過(guò)夜。


    (d)將加入中性蛋白酶II的角膜4℃搖30 min。


    (e)用DMEM/F-12/GASP洗滌角膜。


    (f)解剖顯微鏡下,小心去除上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。


    (g)用塑料刮片輕刮基膜的上皮細(xì)胞面和內(nèi)皮細(xì)胞面。顯微鏡下觀察,以確保完-全去除這些細(xì)胞層。


    (h)用新鮮培養(yǎng)基清洗角膜基質(zhì)一次。


    (i)用手術(shù)刀或安全刀片或精細(xì)手術(shù)剪將基質(zhì)剪碎成2 mm左右的小塊。


    (j)用DMEM/F-12/GASP配制的膠原酶37℃消化3 h,直到大多數(shù)組織消失。


    (k)400g離心10 min,棄上清。


    (l)用DMEM/F-12/GASP重懸細(xì)胞,用70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾消化液,并離心。


    (m)重復(fù)上述清洗步驟兩遍,每遍之后細(xì)胞計(jì)數(shù)。


    (n)用MJM將分離出的間質(zhì)細(xì)胞重懸并以1×104cm2的密度接種于塑料組織培養(yǎng)皿中。


    (o)每3天更換一次培養(yǎng)基。


    (P)當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%匯合時(shí)用胰蛋白酶消化傳代:吸出培養(yǎng)基,用CMF-SalineG洗一次。加人胰蛋白酶或TrypLE至僅僅覆蓋細(xì)胞,37℃,10 min。加人DMEM/F-12/2FB終止消化。細(xì)胞計(jì)數(shù)。將重懸的細(xì)胞離心,棄上清。用足量新鮮配制的MJM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸,以1×104cm2的密度接種


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